【背景】
将体外融合的CRISPR RNPs通过电穿孔的方法，对人体的CD4+ T细胞成功实现基因组编辑。为了了解细胞中HIV病毒和人类宿主细胞之间的相互作用，使用CRISPR RNPs高通量平台实现对宿主细胞中的候选基因高效有序的编辑。使用这种新的基因工具不仅可以成功实现CD4+ T细胞中的基因编辑，同时还可以实现高效的、成对的基因敲除。CRISPR RNPs高通量平台最大的优势是高效、大量、有序的筛选出与某些表型相关的候选基因，该技术能够促进药物靶标确认和细胞水平上HIV病毒感染的治疗。
【方法】
- 编辑人类T细胞中的HIV病毒的宿主因素
- 确认在人类初级T细胞中的HIV候选依赖因素
使用96孔板体外合成不同的Cas9 RNPs重组蛋白，并通过电穿孔的方法将其转入到人类CD4+细胞中可以在一个血液样本中快速的产生几百个不同的，转基因修饰池。
实验流程：从人体血液中纯化出CD4+ T细胞，在抗CD3/CD28刺激下激活；使用电穿孔法将Cas9 RNPs转入，在DNA和蛋白水平上检测基因组编辑情况；这些被编辑过的细胞群体通过多种HIV病毒注射实验来检测功能。
敲除与HIV整合相关的LEDGF基因，设计,6个crRNA用于检测并确认LEDGF基因敲除对人类T细胞的影响。为了有更明显的效果，用另外一种感染方式使用效率更高的crRNA对人类初级T细胞进行感染。
【结论】
- 在DNA水平和蛋白水平证实了Cas9 RNPs成功的对细胞的基因组进行了修饰；
- 应用Cas9 RNPs高通量平台去高效准确的敲除CXCR4和CCR5基因；
- 6个crRNA对LEDGF基因敲除结果显示，其中两个crRNA可以使蛋白表达明显降低，使用其他感染方式对细胞进行感染后发现，3天后细胞内病毒的复制有2～7倍的降低；7天后，效果更加明显，细胞内病毒复制有6～12倍的降低；
- TNPO3基因和LEDGF基因敲除后，细胞可以避免病毒感染。由此可以证明TNPO3基因和LEDGF基因是HIV病毒的依赖因素；
- 单独使用Cas9 RNPs敲除CXCR4基因和CD4+基因与同时敲除两个基因，两者间基因编辑效率没有差别；
- 同时使用Cas9 RNPs对CXCR4和LEDGF基因进行敲除，结果显示单独敲除CXCR4和LEDGF基因或者成对敲除两个基因之间的效率是相同的。由此说明，Cas9 RNPs多重编辑平台可以高效的一站式对成对的基因进行敲除，与单独敲除方法相比效率不变；
- 使用CRISPR-Cas9 RNPs高通量平台可以对人类T细胞系统进行筛选及高通量表型分析，因此对已发表的文献中提到的45个直接或者间接与HIV整合酶相关的基因进行筛选。针对45个基因设计了146个sgRNA，培养48 h时间后使用HIV病毒感染，2～6天后观察结果发现，CXCR4、CDK9、LEDGF、GEMIN2、KPNA1、KPNA5、KAT2A、FAM96B、UNC45A基因敲除后可以抑制HIV病毒的感染。而SMARCB1、XRCC6基因的敲除导致HIV病毒感染的增强；PLOD1、SUCLA2、HDGFRP2、EEEF1A1四个基因至少在一个个体中成为HIV病毒感染的潜在因素。
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参考文献
Hultquist, J.F., et al., A Cas9 Ribonucleoprotein Platform for Functional Genetic Studies of HIV-Host Interactions in Primary Human T Cells. Cell Rep, 2016.17(5): p. 1438-52.